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HPLC/MS analysis of glutathione and ascorbic acid



J Pharm Pharmacogn Res 9(6): 803-812, 2021.

Original article

Rapid qualitative and quantitative HPLC/MS analysis of an antioxidant couple consisted of glutathione and ascorbic acid in a pharmaceutical product

[Análisis cualitativo y cuantitativo rápido por HPLC/MS del par antioxidante glutatión y ácido ascórbico en un producto farmacéutico]

Stanislav V. Yefimov*

Pharmetric Laboratory, 11880 28th St N #210, 33716, St. Petersburg, FL, USA.

*E-mail: stanislav@pharmetriclab.com

Abstract

Context: In pharmacy products, glutathione and vitamin C are often present together. Both components not only enhance each other’s action but also protect each other from oxidation, forming an antioxidant couple. The work is devoted to the development of an HPLC method for determining the activity of pharmaceutical preparations containing the antioxidant couple as an active substance.

Aims: Develop and validate an HPLC/MS method for the determination of an antioxidant couple of glutathione and ascorbic acid in pharmaceutical products. The method should be fast and simple, that is, analyze both components in one run without derivatization and any preliminary sample preparation.

Methods: The Agilent 6125 C SQ LS/DAD/MS instrument was used to detect the two active components simultaneously. MSD was used to detect glutathione; DAD was used to detect ascorbic acid.

Results: The run time was 2.0 min. Glutathione was eluted with a retention time of 1.48 min. Its limit of detection was 0.03 μg. Ascorbic acid was eluted with a retention time of 1.02 min. Its limit of detection was 0.01 μg. Recovery of glutathione varied from 92 to 105%, and the recovery of ascorbic acid varied from 99 to 100%. In positive electrospray ionization mode, the spectra of glutathione (Glut.) showed the predominant signals at m/z+ of 308.2, which corresponds to cation (Glut.-H+). Ascorbic acid(AA) is converted into several cations, including AA-H+ and 2AA-Na+, m/z+= 177 and 375.

Conclusions: The developed HPLC/MS method for the determination of antioxidant couple consisted of glutathione and ascorbic acid in nasal spray and injection solution was validated for accuracy/recovery, precision, and selectivity.  The use of a tandem of a mass spectrometric detector and a diode-array detector is substantiated. The method is fast, simple, sensitive and reproducible, and is suitable for the determination of the antioxidant couple in pharmaceutical products without derivatization or any preliminary sample preparation.

Keywords: antioxidant couple; ascorbic acid; glutathione; LC/MS; potency; RP-HPLC; validation.

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Resumen

Contexto: En los productos farmacéuticos, el glutatión y la vitamina C suelen estar presentes juntos. Ambos componentes no solo mejoran la acción del otro, sino que también se protegen entre sí de la oxidación formando una pareja antioxidante. El trabajo está dedicado al desarrollo de un método HPLC para determinar la potencia de los productos farmacéuticos que contienen el par de antioxidantes como componente activo.

Objetivos: Desarrollar y validar un método HPLC/MS para la determinación del par antioxidante compuesto por glutatión y ácido ascórbico en productos farmacéuticos. El método es rápido y simple, pues analiza ambos componentes en una sola ejecución sin derivatización y sin preparación preliminar de la muestra.

Métodos: Se utilizó el instrumento Agilent 6125 C SQ LS/DAD/MS para detectar los dos componentes activos simultáneamente. Se utilizó un detector de espectrometría de masas para detectar el glutatión. Se utilizó un detector de arreglo de diodos para detectar el ácido ascórbico.

Resultados: El tiempo de ejecución fue de 2,0 min El glutatión se eluyó con un tiempo de retención de 1,48 min, su límite de detección fue de 0,03 μg. El ácido ascórbico se eluyó con un tiempo de retención de 1,02 min, su límite de detección fue de 0,01 μg. La recuperación de glutatión varió de 92 a 105% y la recuperación de ácido ascórbico varió de 99 a 100%. En el modo de ionización por electropulverización positiva, los espectros de glutatión (Glut) mostraron las señales predominantes en m/z+ de 308,2 que corresponde al catión (Glut.-H+). El ácido ascórbico (AA) se convierte en varios cationes, incluidos AA-H+ y 2AA-Na+, m/z+ = 177 y 375.

Conclusiones: El método HPLC/MS desarrollado para la determinación del par de antioxidantes glutatión y ácido ascórbico en aerosol nasal y solución de inyección fue validado por exactitud/recuperación, precisión y selectividad, así como bajo límite de detección y cuantificación. Se comprobó la validez del uso de detectores de arreglo de diodos y espectrometría de masas. El método es rápido, simple, sensible y reproducible, y es adecuado para la determinación del par antioxidante en productos farmacéuticos sin derivatización ni preparación previa de muestras.

Palabras Clave: ácido ascórbico; glutatión; LC/MS; par antioxidante; potencia; RP-HPLC; validación.

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Citation Format: Yefimov SV (2021) Rapid qualitative and quantitative HPLC/MS analysis of an antioxidant couple consisted of glutathione and ascorbic acid in a pharmaceutical product. J Pharm Pharmacogn Res 9(6): 803–812.

© 2021 Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research (JPPRes)

Effect of GSH on human epithelial cells


J Pharm Pharmacogn Res 9(2): 175-181, 2021.

Original Article

The role of reduced glutathione on oxidative stress, reticulum endoplasmic stress and glycation in human lens epithelial cell culture

[Papel del glutatión reducido sobre el estrés oxidativo, el estrés endoplásmico del retículo y la glicación en el cultivo de células epiteliales del cristalino humano]

Nina Handayani1*, Nur Permatasari2, Hidayat Sujuti3, Achmad Rudijanto4

1Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine, Brawijaya University, Saiful Anwar Hospital Malang, Malang 65145, Indonesia.

2Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, Brawijaya University, Malang 65145, Indonesia.

3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, Brawijaya University, Malang 65145, Indonesia.

4Division of Endocrinology and Metabolic Disease, Department of Internal Medicine, Faculty of Medicine, Brawijaya University, Saiful Anwar Hospital Malang, Malang 65145, Indonesia.

*E-mail: nina_handayani@ub.ac.id, ninahdyn@gmail.com

Abstract

Context: Cataracts are currently the main cause of blindness worldwide. This condition caused by a low concentration of reduced glutathione (GSH) in the lens.

Aims: To evaluate the effect of glutathione (GSH) on the hyperglycemia-induced oxidative stress, reticulum endoplasmic stress, and glycation in human lens epithelial cells.

Methods: Human lens epithelial cells were cultured under high-glucose conditions. Malondialdehyde (MDA), protein carbonyl content (PCC), glucose reactive protein (GRP), and advanced glycation end product (AGE) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay after 72 h of incubation for MDA, PCC, GRP and after 2 weeks incubation for AGE.

Results: The MDA and PCC levels increased in response to high-dose glucose administration compared to the control group.  MDA and PCC levels were decreased at all GSH doses, whereas the lowest mean MDA and PCC levels were observed at GSH doses of 10 and 100 μM, respectively.  GRP levels increased after high-glucose administration as compared to the control group. Additionally, the groups co-treated with 30 and 100 μM GSH showed reduced PCC. The AGE level was reduced at all doses of GSH compared to those in the control group.

Conclusions: The results suggest that GSH inhibits oxidative stress, reticulum endoplasmic stress, and AGE formation, which may lead to the progression of diabetic cataract. Additionally, GSH may maintain lens transparency by acting as an antiglycation and controlling the AGE formation.

Keywords: glycation; glutathione; glucose reactive protein; hyperglycemia; malondialdehyde; oxidative stress.

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Resumen

Contexto: Las cataratas son actualmente la principal causa de ceguera en todo el mundo. Esta condición es causada por una baja concentración de glutatión reducido (GSH) en el cristalino.

Objetivos: Evaluar el efecto del glutatión (GSH) sobre el estrés oxidativo inducido por la hiperglucemia, el estrés endoplásmico del retículo y la glicación en las células epiteliales del cristalino humano.

Métodos: Se cultivaron células epiteliales del cristalino humano en condiciones de alto contenido de glucosa. El malondialdehído (MDA), el contenido de carbonilo proteico (PCC), la proteína reactiva a la glucosa (GRP) y el producto final de glicación avanzada (AGE) se midieron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas después de 72 h de incubación para MDA, PCC, GRP y después de 2 semanas incubación para AGE.

Resultados: Los niveles de MDA y PCC aumentaron en respuesta a la administración de glucosa en dosis altas en comparación con el grupo de control. Los niveles de MDA y PCC disminuyeron en todas las dosis de GSH, mientras que los niveles medios más bajos de MDA y PCC se observaron en dosis de GSH de 10 y 100 μM, respectivamente. Los niveles de GRP aumentaron después de la administración de glucosa alta en comparación con el grupo control. Además, los grupos tratados conjuntamente con 30 y 100 µM de GSH mostraron una reducción del PCC. El nivel de AGE se redujo en todas las dosis de GSH en comparación con las del grupo de control.

Conclusiones: Los resultados sugieren que GSH inhibe el estrés oxidativo, el estrés endoplásmico del retículo y la formación de AGE, lo que puede conducir a la progresión de la catarata diabética. Además, GSH puede mantener la transparencia de la lente actuando como antiglicación y controlando la formación de AGE.

Palabras Clave: estrés oxidativo; glicación; glutatión; hiperglucemia; malondialdehído; proteína reactiva a la glucosa.

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Citation Format: Handayani N, Permatasari N, Sujuti H, Rudijanto A (2021) The role of reduced glutathione on oxidative stress, reticulum endoplasmic stress and glycation in human lens epithelial cell culture. J Pharm Pharmacogn Res 9(2): 175–181.

© 2021 Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research (JPPRes)